【主要看点】

之前已有报道，在RAR信号通路中，RARβ的表达在转录水平上受RARα的调控。为进一步确定本研究中的具体调控机制，经WB、细胞侵袭实验、Co-IP、ChIP-qPCR等实验技术，发现并验证了主要研究因子CCL28通过抑制RARα和HDAC1的相互作用，从而促进RARβ的表达。

【资料来源】

JCI, 2019, CCL28-induced RARβ expression inhibits oral squamous cell carcinoma bone invasion.

Fig.4 CCL28 upregulates RARβ expression via RARα-mediated transcription by reducing the interaction between RARα and HDAC1.

【关键知识】

Co-IP：免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的，用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”（pull-down）下来，进而后续可以通过WB、MS等手段，鉴定该蛋白复合物中的其他未知成员。

ChIP：染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation）技术，是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。其基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白质结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP实验后，一般还需做qPCR或测序。其中，ChIP-qPCR是用来研究目的转录因子和预测的某个基因的启动子是否存在结合、集合的区域是哪一段，根据预测基因ORF区域上游2000-3000bp范围分段设计引物。

DNMT：DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase）。DNA甲基化为DNA化学修饰的一种形式，是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

HDAC：组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase）是一类蛋白酶，对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。一般情况下，组蛋白的乙酰化有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录。而组蛋白的去乙酰化则发挥相反的作用。

【结果展示】

Step 1：分别对Ca9.22及YD10B细胞进行CCL28处理，经Western Blot、细胞迁移实验，检测了在不同浓度的药物处理下细胞迁移变化情况。

* ER50891为RARα的选择性拮抗剂。

实验结果显示，ER50891阻断了CCL28介导的RARβ及RAR2β表达上调、细胞迁移，表明了RARα在该通路中、影响RARβ的表达上发挥着重要作用。

Step 2：对Ca9.22及YD10B细胞进行CCL28处理后提取核蛋白，以RARα的IP抗体进行Co-IP实验，其后通过Western Blot，检测拉下来的蛋白复合物中HDAC、DNMT的含量变化。

实验结果显示，CCL28的处理只对RARα与HDAC1的结合有影响，其他蛋白则无明显变化。

Step 3：对Ca9.22及YD10B细胞进行CCL28处理后，以组蛋白H3、乙酰化组蛋白H3、HDAC1的IP抗体进行ChIP实验，其后通过qPCR，检测拉下来的DNA中RARB的启动子区域含量。

实验结果显示，CCL28的处理使组蛋白H3的乙酰化水平升高、而HDAC1的水平下降，即表明RARB的转录水平升高。

【相关试剂】

WB检测试剂盒 凯基，KGP1201，10 tests，945元

6-petal GradientEZ 3D cell migration Lena Biosciences，GT 2019LS-001，2399-2699元

6-lobe GradientEZ 3D cell migration Lena Biosciences，GT 2019LS-002，2399-2699元

RARα拮抗剂AR7 Selleck，S6605，5mg，795元

Histone H3 Rabbit pAb ABclonal，A2348，WB/IHC/IF/ChIP，50uL，900元

Acetyl-Histone H3-K56 Rabbit pAb ABclonal，A7256，WB/IHC/IF/IP/ChIP/ChIPseq，50uL，1200元