【主要看点】

通过RNA测序、荧光素酶检测、免疫印迹、qRT-PCR等实验技术，发现并验证了主要研究因子SRSF1可促进PTEN的表达，从而抑制mTORC1信号通路的激活，最终对T细胞的过度活跃产生影响。

 

【参考来源】

JCI, 2019, Splicing factor SRSF1 controls T cell hyperactivity and systemic autoimmunity

Fig.4 T cells from Srsf1-cKO mice exhibit increased activation of the mTORC1 pathway and reduced expression of PTEN.

 

【关键知识】

mTOR信号通路：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸激酶，存在于两个不同的复合体中。第一个为mTOR复合体1（mTORC1），由mTOR、Raptor、GβL和DEPTOR构成；第二种复合体是mTOR复合体2（mTORC2），由mTOR、Rictor、GβL、Sin1、PRR5/Protor-1和DEPTOR构成。mTOR信号转导异常见于多种疾病，如癌症、心血管疾病和糖尿病。

PTEN：具有磷酸酯酶的活性，可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性，可抑制肿瘤的发生发展。

3’-UTR荧光素酶检测：将研究基因mRNA的3’-UTR插入带有荧光素酶报告基因的载体中，其后进行相关刺激，通过检测荧光强度观察不同刺激手段下对荧光素酶表达的影响，从而可测定上游刺激对下游靶基因在转录水平的影响。

 

【结果展示】

Step 1：流式分选Srsf1-cKO 小鼠、野生型小鼠的T细胞，其后分别进行RNA测序，分析各关键通路因子的表达差异。

实验结果显示，Srsf1基因被敲除后，T细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路的几个关键因子均有不同程度的影响；其中，该通路的抑制因子PTEN的表达明显下调。

Step 2：通过Western Blot，检测mTOR信号通路中关键活化因子的磷酸化情况，确定在Srsf1-cKO 小鼠T细胞中mTOR信号通路的激活情况。

实验结果显示，Srsf1基因被敲除的小鼠T细胞中，S6、AKT在自身表达情况无明显变化的情况下，其磷酸化情况明显上升，即Srsf1敲除后增加了mTOR信号通路的激活。

Step 3：为进一步确定在Srsf1-cKO 小鼠T细胞中PTEN表达下调的原因，通过qRT-PCR、Western Blot在其mRNA及蛋白水平上进行验证。

实验结果显示，Srsf1-cKO 小鼠T细胞中PTEN的mRNA、蛋白表达均有明显的下调。

Step 4：由于之前已有报道显示SRSF1一般是通过与下游基因3’-UTR结合，在转录后调控水平上影响基因的表达，故在此选择进行3’-UTR荧光素酶检测，确定SRSF1调控PTEN表达水平的机制。

实验结果显示，SRSF1主要作用于Pten mRNA 3’-UTR，从而影响PTEN蛋白的表达；SRSF1的过表达可促进PTEN的表达，SRSF1的被敲除后PTEN的表达明显被抑制，且在SRSF1回复后PTEN的表达也随之回复。

【相关试剂】

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